ΓΕΝΙΚΗ ΑΙΜΑΤΟΣ - ΠΑΓΙΔΕΣ ΣΤΙΣ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΜΕ ΤΟΥΣ ΑΥΤΟΜΑΤΟΥΣ ΑΝΑΛΥΤΕΣ

ΓΕΝΙΚΗ ΑΙΜΑΤΟΣ - ΠΑΓΙΔΕΣ ΣΤΙΣ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΜΕ ΤΟΥΣ ΑΥΤΟΜΑΤΟΥΣ ΑΝΑΛΥΤΕΣ
Γεώργιος Πατεράκης
Επιμελητής Β’, Ανοσολογικό Εργαστήριο και Εθνικό Κέντρο Ιστοσυμβατότητας, ΠΓΝΑ “ Γ. Γεννηματάς”, Αθήνα

ΚΥΡΙΑ ΣΗΜΕΙΑ  
Η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων των μετρήσεων των αυτομάτων αναλυτών είναι δυνατόν να παραβλαφθεί από μια σειρά σφαλμάτων, λαθών και artifacts.

Μία σειρά παραγόντων πριν την ανάλυση μπορεί να επηρεάσει την αξιοπιστία των ιδίων των μετρήσεων και πρέπει να ελέγχεται

Οι αυτοματοποιημένες μετρήσεις απαιτούν στενό εσωτερικό ποιοτικό έλεγχο λόγω της ταχείας παραγωγής αποτελεσμάτων.

Ανωμαλίες του δείγματος σε αλληλεπίδραση με την αρχή μέτρησης του αναλυτή μπορεί να είναι υπεύθυνα για μία σειρά από artifacts.

Τα artifacts συχνά δημιουργούν διαγνωστικές παγίδες και για τον λόγο αυτό πρέπει να αναγνωρίζονται έγκαιρα.

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Ο σύγχρονος κλινικός γιατρός έρχεται καθημερινά σε επαφή με εκτυπώσεις αυτομάτων αναλυτών που, περιλαμβάνουν αριθμητικά δεδομένα και γραφικές παραστάσεις. Η πληθώρα των μηχανημάτων, οι ιδιαιτερότητες που παρουσιάζουν και οι συνεχείς καινοτομίες των κατασκευαστών, αναμφίβολα δημιουργούν ένα γενικότερο κλίμα σύγχυσης.  
Μέσα σε ένα καθεστώς αυτόματης και γρήγορης παραγωγής αποτελεσμάτων, τυχόν σφάλματα εύκολα μπορεί να εισχωρήσουν σε μεγάλο αριθμό απαντήσεων. Ο μεγάλος αριθμός γενικών αίματος από την άλλη πλευρά οδήγησε σε μία τακτική επιλεκτικής εξέτασης στο μικροσκόπιο μόνο των επισημαινόμενων παθολογικών δειγμάτων από το software του αναλυτή. Μία σειρά παράγοντες, που επιδρούν στην αξιοπιστία των μετρήσεων μπορεί να οδηγήσουν σε ατυχείς διαγνωστικούς και θεραπευτικούς χειρισμούς, όντας πραγματικές παγίδες στην καθημερινή κλινική πράξη.

2. ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑ, ΣΦΑΛΜΑΤΑ, ΛΑΘΗ, ΑRTIFACTS
Τι εννοούμε όταν λέμε ότι παραβλάπτεται η αξιοπιστία; Μία μέτρηση χαρακτηρίζεται από αυθεντικότητα ή εγκυρότητα (accuracy) όταν ανταποκρίνεται στην πραγματική τιμή (επιστημονικά αληθινή) και χαρακτηρίζεται από ακρίβεια (precision), όταν υπάρχει επαναληπτότητα (reproducibility) στις μετρήσεις του ιδίου δείγματος. 
Αξιόπιστες είναι οι μετρήσεις που συνδυάζουν εγκυρότητα και επαναληπτότητα. Παράγοντες που παραβλάπτουν την αξιοπιστία μπορεί να υπεισέρχονται στην καθ’ αυτό ανάλυση του δείγματος, δηλαδή την μέτρηση στον αυτόματο αιματολογικό αναλυτή ή να αφορούν την μη-αναλυτική, όπως λέμε, διαδικασία. Η δεύτερη ξεκινάει με τον άρρωστο ή το δείγμα, την προετοιμασία μέχρι την ανάλυση στον αυτόματο αναλυτή (προαναλυτική φάση), την επεξεργασία και απόδοση του αποτελέσματος, που φθάνει στον τελικό αποδέκτη (μετα-αναλυτική φάση).
Mε τον όρο σφάλματα (errors) εννοούμε συστηματική ή τυχαία απώλεια της αξιοπιστίας των αποτελεσμάτων που δεν οφείλεται όμως σε κάποιο λάθος. Με τον όρο λάθος (mistake) εννοούμε ότι υπεισέρχεται κακή πρακτική ή τεχνική σε κάποια φάση της αναλυτικής ή μη διαδικασίας από την σωστή αντιστοίχηση δείγματος-ασθενούς, την σωστή χρήση αντιδραστηρίων και χειρισμό του αναλυτή κατά τις προδιαγραφές του κατασκευαστή μέχρι την αντιγραφή και αποστολή των αποτελεσμάτων στον σωστό αποδέκτη. Τα σφάλματα παραβλάπτουν την αυθεντικότητα των αποτελεσμάτων και δεν γίνονται αντιληπτά εγκαίρως αν δεν τηρηθούν διαδικασίες εσωτερικού ελέγχου ποιότητας (internal quality control). 
H απορρύθμιση (decalibration) ενός αιματολογικού αναλυτή είναι κλασσικό παράδειγμα σφάλματος, που επιδέχεται διόρθωση (ρύθμιση, calibration). Το σφάλμα αυτό υπεισέρχεται σε όλες τις μετρήσεις και λέγεται συστηματικό. 
Υπάρχουν εν τούτοις συστηματικά σφάλματα, συνυφασμένα με την αρχή μέτρησης ενός συγκεκριμένου αναλυτή τα οποία ονομάζονται εγγενή (innate) και δεν επιδέχονται διόρθωσης. Τα τυχαία σφάλματα υπεισέρχονται σε ανεξάρτητα δείγματα, έτσι ώστε να επηρεάζεται η ακρίβεια των μετρήσεων. Οφείλονται συνήθως σε τεχνικά προβλήματα του αναλυτή. Εσφαλμένες μετρήσεις κάποιων συγκεκριμένων δειγμάτων με ιδιομορφίες λόγω φαινομένων artifacts έχουν ιδιαίτερο κλινικό ενδιαφέρον γιατί αποτελούν τις κατ’ εξοχήν διαγνωστικές παγίδες. Πρέπει να αντιδιαστέλλονται από τα τυχαία σφάλματα ώστε να μη αναζητούνται τεχνικά προβλήματα στον αναλυτή αφού το σφάλμα ανακύπτει από την ιδιαιτερότητα της αλληλλεπίδρασης δείγματος-αναλυτή.

  3. ΠΡΟΑΝΑΛΥΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΙΔΡΟΥΝ ΣΤΗΝ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
- Γραφειοκρατικά λάθη αντιστοίχησης ασθενούς και δείγματος αυξάνονται με τον φόρτο και την πίεση ανάλυσης και υπολογίζονται σε 1-2%.
- Είδος αιμοληψίας. Το δείγμα μπορεί να ληφθεί με φλεβοκέντηση ή σπανιότερα με νύξη του δακτύλου, πτέρνας ή λοβίου του ωτός. Δεν φαίνεται να υπάρχουν εν γένει διαφορές μεταξύ αίματος από την φλέβα ή το δάκτυλο πλην απροσδιόριστων μειώσεων του αριθμού των αιμοπεταλίων στη δεύτερη περίπτωση. Αντίθετα τα δείγματα από το λοβίο έχουν υψηλότερες τιμές Hb, RBC και Hct. Η δράση της περίσφιξης, ενώ είναι σημαντική στις μετρήσεις της αιμόστασης, δεν φαίνεται ότι επιδρά σημαντικά στις μετρήσεις των εμμόρφων στοιχείων του αίματος.
- Αντιπηκτικά. Το EDTA υπάρχει σε τρικαλιούχο υγρή μορφή (Κ3) και δικαλιούχο σκόνη (Κ2). Οι συγκεντρώσεις του μπορεί να κυμαίνονται από 1,5 έως 7,5 mg/ml αίματος. Το Κ3 σε συγκέντρωση μόλις 1,5mg/ml επιφέρει κατά μέσο όρο 3% χαμηλότερο μικροαιματοκρίτη (φυγοκεντρικό) από Κ2 της ίδιας συγκέντρωσης. Αυτό οφείλεται στην συρρικνωτική δράση του Κ3 πάνω στα ερυθρά. Η διαφορά αυτή επιδρά στην ρύθμιση του Hct και MCV των αυτομάτων αναλυτών. Συρρικνωτική δράση αποκτά και το Κ2 σε μεγάλες συγκεντρώσεις. Ως εκ τούτου, η ρύθμιση των αυτομάτων αναλυτών, πρέπει να γίνεται με μικροαιματοκρίτη που έχει ληφθεί σε Κ2 σε συγκέντρωση 1,5-2 mg/ml. H ηπαρίνη σε συγκέντρωση 10-20 IU/ml μπορεί να προκαλέσει 3-5% αύξηση των τιμών της αιμοσφαιρίνης των αναλυτών, γιατί προκαλεί θολερότητα του αιμολύματος, ενώ ενοχοποιείται και για αύξηση 1,5% των τιμών του μικροαιματοκρίτη.
- Σωστή αναλογία όγκου αίματος και αντιπηκτικού, ιδιαίτερα όταν γίνεται φυγοκεντρικός μικροαιματοκρίτης για τη ρύθμιση των αναλυτών (όπως εξηγήσαμε πιο άνω). Εν τούτοις, όταν η ποσότητα του αίματος είναι μικρότερη μέχρι και 75% από την προβλεπόμενη, αν και αυξάνεται η οσμωτική συγκέντρωση του αντιπηκτικού δεν μεταβάλλεται ο MCV του αναλυτή και το σφάλμα που υπεισέρχεται στις μετρήσεις των αναλυτών δεν είναι σημαντικό στην πράξη. Κακή τεχνική αιμοληψίας (εργώδης κλπ) ή κακή ανάδευση (υπερπλήρωση φιαλιδίου) σχετίζεται με παραγωγή πηγμάτων ή μικροθρόμβων (ψευδοθρομβοπενία), αιμόλυση, ψευδοαναιμία (λήψη από την IV γραμμή). Η είσοδος οινοπνεύματος στο δείγμα προκαλεί αιμόλυση. Η ορθή τεχνική επιστρώσεων από φρέσκο αίμα πριν την δράση του αντιπηκτικού αξίζει να τονιστούν αν και αφορούν τον εργαστηριακό γιατρό και την σωστή εκτίμηση της μορφολογίας στο μικροσκόπιο.
- Καθυστέρηση της ανάλυσης του δείγματος επιδρά στις μετρήσεις όταν υπερβαίνει τις 6 ώρες. Ειδικά επηρεάζονται ο μέσος όγκος των αιμοπεταλίων (MPV) και ο αριθμός των μονοκυττάρων (του αναλυτή). Αυξάνονται οι επισημάνσεις (flags) του αναλυτή στα λευκά αιμοσφαίρια ιδιαίτερα όταν τα δείγματα παρέμειναν σε θερμοκρασία δωματίου και ο αυτόματος διαφορικός λευκοκυτταρικός τύπος γίνεται αναξιόπιστος. Όταν το δείγμα μείνει εντός ψυγείου οι μεταβολές στο MCV μέχρι 24 ώρες δεν είναι σημαντικές. Στη θερμοκρασία δωματίου σε 24 ώρες αυξάνεται ο MCV περί το 1,5% και κατά συνέπεια και ο αιματοκρίτης του αναλυτή, δεν παρατηρείται όμως ανάλογη μεταβολή στον μικροαιματοκρίτη. Εντός ψυγείου παρατηρείται ελάττωση του αριθμού των αιμοπεταλίων (30% σε 24 ώρες) που δεν επισυμβαίνει σε θερμοκρασία δωματίου.
- Η κακή ανάδευση κατά την χειρωνακτική τροφοδότηση των δειγμάτων στον αιματολογικό αναλυτή είναι σύνηθες φαινόμενο και οδηγεί σε τυχαία σφάλματα.

4. ΑΝΑΛΥΤΙΚΟΙ ΚΑΙ ΜΕΤΑ-ΑΝΑΛΥΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΑΝΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ
Κάθε αιματολογικό εργαστήριο οφείλει να ακολουθεί διαδικασίες εσωτερικού ελέγχου ποιότητας (internal quality control), με στόχο την έγκαιρη ανίχνευση συστηματικών σφαλμάτων. Σε δεύτερη φάση ακολουθούνται διαδικασίες αποκατάστασης της εκτροπής, δηλαδή διαδικασίες ρύθμισης (calibration). Ο ρόλος του κλινικού γιατρού στον εσωτερικό έλεγχο ποιότητας εξ’ ορισμού δεν έχει θέση διότι αν ανακαλύπτονται συστηματικά σφάλματα από τον κλινικό σημαίνει ότι δεν λειτουργεί ο εν λόγω έλεγχος. Τα τυχαία σφάλματα τα οποία δεν οφείλονται σε κάποια ανωμαλία του δείγματος αποτελούν πονοκέφαλο για τον εργαστηριακό γιατρό και συχνά υποκρύπτουν τεχνικό πρόβλημα ή παραμελημένη συντήρηση και συμμόρφωση με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Απλές και χρήσιμες χειρωνακτικές μέθοδοι, που ελέγχουν την μέτρηση των εμμόρφων στοιχείων του αίματος με τους αναλυτές, είναι η διενέργεια του μικροαιματοκρίτη στην μικροφυγόκεντρο και η χρώση και εκτίμηση των επιχρισμάτων στο οπτικό μικροσκόπιο. Ο μικροαιματοκρίτης αποτελεί λίαν αξιόπιστη εξέταση όταν διενεργείται και διαβάζεται σωστά.
Ο εργαστηριακός γιατρός οφείλει να γνωρίζει τους περιορισμούς της τεχνολογίας των αναλυτών στην αξιολόγηση της μορφολογίας παθολογικών δειγμάτων. Από την άλλη πλευρά, υπάρχουν ανάλογοι περιορισμοί και της οπτικής εκτίμησης των εμμόρφων στοιχείων. Για παράδειγμα, ο διαφορικός λευκοκυτταρικός τύπος (5 υποπληθυσμών), που παρέχουν οι σύγχρονοι νοσοκομειακοί αιματολογικοί αναλυτές στα φυσιολογικά δείγματα είναι πλέον αξιόπιστος από τον χειρωνακτικό (για καθαρά στατιστικούς λόγους). Αντίθετα η παρουσία ανωμάλων μορφών λευκοκυττάρων απαιτεί την εξαγωγή λευκοκυτταρικού τύπου στο μικροσκόπιο και σε καμιά περίπτωση δεν επαφίεται κανείς στις επισημάνσεις του αναλυτή ("βλάστες", "εμπύρηνα ερυθρά "κοκ). Η μορφολογική εξέταση και η αυτόματη ανάλυση δεν πρέπει να αντιμετωπίζονται σαν ανταγωνιστικά πεδία αφού κατ' ουσίαν αλληλοσυμπληρώνονται. Συχνά δεν αξιολογούνται από τους κλινικούς οι επισημάνσεις σφάλματος (error flags) του αναλυτή. Έτσι π.χ. εκλαμβάνεται από τον κλινικό ένας υψηλός αριθμός αιμοπεταλίων σαν πραγματικός, ενώ στην ουσία είναι φανερή στο ιστόγραμμα η παρεμβολή των μικροποικιλοκυττάρων στην μέτρηση και η επισήμανση. Δυστυχώς η επισήμανση αυτή γίνεται με κωδικοποιημένο τρόπο (αστερίσκο, αλφαριθμητικό σύμβολο κ.ο.κ), με τον οποίο δεν είναι εξοικειωμένος ο κλινικός. Σε κάθε περίπτωση επιβάλλεται το εργαστήριο να διορθώνει τις επισημαινόμενες εσφαλμένες μετρήσεις στο αποστελλόμενο αποτέλεσμα.

5. ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΕΣ ΠΑΓΙΔΕΣ ΛΟΓΩ ΑΝΩΜΑΛΙΑΣ ΣΤΟ ΔΕΙΓΜΑ ( ARTIFACTS)
Αν και υποστηρίζεται ότι κάθε αρχή βιολογικής μέτρησης βασίζεται σε artifact, πρέπει να τονιστεί ότι το artifact, σαν διαγνωστική παγίδα στους αυτόματους αναλυτές, επιβάλλει άμεση αναγνώριση έτσι ώστε να γίνει η σωστή ερμηνεία του φαινομένου και να μη θεωρηθεί σαν απορύθμιση του αναλυτή, αλλά σαν ανωμαλία του δείγματος.
 
5.1 ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤAΡΙΚΕΣ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ
Στον πίνακα Ι φαίνονται τα κυριότερα σφάλματα που επιδρούν στις ερυθροκυτταρικές παραμέτρους και οφείλονται σε κάποια ανωμαλία του δείγματος.
------------------------------------------------------------------------------------------------
αίτιο                                  ερυθροκυτταρική παράμετρος που επηρεάζεται
------------------------------------------------------------------------------------------------
παραπρωτεϊναιμία                              Hb, MCH, MCHC

υπετριγλυκαιριδαιμία                           Hb, MCH, MCHC

υπερλευκοκυττάρωση                       Hb, RBC, Hct, MCV, MCH, MCHC

ψυχροσυγκολλητίνες                          RBC, Hct, MCV, MCH, MCHC

αιμόλυση                                             Hct, MCV, MCH, MCHC

έντονη μικροκυττάρωση                       RBC, Hct, MCV, MCH, MCHC

έντονη υποχρωμία-υπερχρωμία                    Ηct, MCV, MCHC

υπερ-υπο οσμωτικότητα                               Hct, MCV, MCHC
------------------------------------------------------------------------------------------------

Όταν τα τριγκυκερίδια ξεπερνούν τα 1000mg/ml ή η παραπρωτεϊνη ΙgM τα 3g/l, μεταβάλλεται η θολερότητα του αιμολύματος στην φωτομετρική κυψελίδα των αναλυτών, αλλά και στην χειρωνακτική αιμοσφαιρινομετρία. Όταν η υπερεκτίμηση της αιμοσφαιρίνης είναι πάνω από 2gr/dl, οι τιμές του MCHC είναι παράλογα υψηλές. Η αυξημένη χοληστερόλη δεν προκαλεί θολερότητα.
Οι ψυχροσυγκολλητίνες προκαλούν μείωση του αριθμού των ερυθρών και αύξηση του MCV, γιατί δυάδες ερυθρών μετρούνται σαν μόνοι παλμοί. Το φαινόμενο παρατηρείται σε όλους τους αναλυτές, ανεξάρτητα από την αρχή μέτρησης. Στην τυπική του μορφή το artifact εμφανίζεται με τιμές MCHC παράλογα υψηλές. Το σφάλμα επιτείνεται με την παρέλευση του χρόνου, ενώ είναι δυνατόν στις επείγουσες μετρήσεις να μην αναδειχθεί ανωμαλία ιδιαίτερα αν ο τίτλος είναι χαμηλός. Έχουν περιγραφεί άτυπες περιπτώσεις με μικρή αύξηση του MCV στην περιοχή των ανωτέρων φυσιολογικών τιμών. Αν μάλιστα συνυπάρχει κάποιος βαθμός δικτυοερυθροκυττάρωσης, μπορεί να παραπλανήσει τον γιατρό και να της αποδώσει την μακροκυττάρωση. Το δείγμα δεν είναι ανάγκη να φθάνει στο εργαστήριο μέσα σε υδατόλουτρο, όταν υπεισέρχεται μόνο μηχανισμός συγκόλλησης (χωρίς αιμόλυση) αφού αναστρέφεται οποιαδήποτε στιγμή μετά από επώαση στους 37 βαθμούς C για 10 λεπτά.
Εντονότατη μικροκυττάρωση, κάτω των 25 fl εκτός από την παρεμβολή στις μετρήσεις των αιμοπεταλίων (βλ. κατωτέρω) δημιουργεί πρόβλημα σε αναλυτές στους οποίους υπάρχει σταθερός κατώτερος ουδός στα ερυθρά στα 36 fl. Η απώλεια αρίθμησης ερυθρών οδηγεί σε πλασματική αύξηση των δεικτών. Όταν τα ερυθρά είναι πολύ υπόχρωμα ή υπέρχρωμα επηρεάζεται η παραμορφωσιμότητά τους. Σε ορισμένους αναλυτές οπής η ρύθμιση της μέτρησης του όγκου γίνεται με βάση τα φυσιολογικά ερυθρά. Έτσι τα ανώμαλα ερυθρά "φαίνονται" πλασματικά μικρότερα όταν έχουν μεγάλη παραμορφωσιμότητα (υπόχρωμα λεπτοκύτταρα) ή αντίθετα πλασματικά μεγαλύτερα όταν είναι δύσκαμπτα (σφαιροκύτταρα). Το φαινόμενο δεν παρατηρείται με την ίδια ένταση σε όλους τους αναλυτές οπής ούτε στους αναλυτές με σκεδασμό laser στην μέτρηση των ερυθρών. Το σφάλμα αυτό είναι συστηματικό και εγγενές και δεν μπορεί να διορθωθεί. Σαν αποτέλεσμα παραβλάπτεται στις ανώμαλες περιπτώσεις ο υπολογισμός του αιματοκρίτη του αναλυτή και των ερυθροκυτταρικών δεικτών. Πρέπει συνεπώς να γίνει σαφές στον κλινικό γιατρό ότι δεν έχουν όλοι οι αναλυτές δυνατότητα έγκυρης μέτρησης της MCHC παρά μόνο εκείνοι στους οποίους δεν υπεισέρχεται το εν λόγω σφάλμα λόγω επίδρασης του παράγοντα σχήματος των ερυθρών.

Όταν ο αριθμός των λευκών ξεπερνά τις 30Χ109/l σταδιακά υπεισέρχεται σφάλμα θολερότητας στην μέτρηση της Hb. Ο αναλυτής συμπεριλαμβάνει στην μέτρηση των ερυθρών και τα λευκά τα οποία υπό συνήθεις συνθήκες είναι πολύ λίγα ώστε να επηρεάσουν την μέτρηση. Οι παλμοί των λευκών που σε κανονικές συνθήκες είναι αμελητέοι συμπεριλαμβάνονται με εκείνους των ερυθρών και παραβλάπτουν την μέτρηση του Hct και των δεικτών όταν υπάρχει υπερλευκοκυττάρωση (>100χ109/l). Στις περιπτώσεις αυτές η παρεμβολή είναι εντονότερη στον αιματοκρίτη λόγω πλασματικής αύξησης του MCV. Επειδή λόγω της θολερότητας έχουμε πλασματική αύξηση της αιμοσφαιρίνης οι δείκτες MCH και MCHC δεν επηρεάζονται υπερβολικά.

Σε ασθενείς με οσμωτικές διαταραχές συμβαίνει το φαινόμενο της οσμωτικής αντιρρόπησης των ερυθρών μέσα στο ισότονο διάλυμα του αναλυτή. Όταν τα ερυθρά που βρίσκονται σε υπέρτονο πλάσμα αραιωθούν στο υγρό του αναλυτή, η οσμωτικά δραστική ουσία βρίσκεται σε υψηλή συγκέντρωση στο εσωτερικό τους, καθυστερεί να διακινηθεί προς τα έξω μέσα στα στενά χρονικά πλαίσια της μέτρησης μέσα σε μερικά δευτερόλεπτα και έτσι εισέρχεται διάλυμα του αναλυτή στο εσωτερικό του ερυθρού το οποίο διογκώνεται. Η κλινική σημασία των παρατηρήσεων αυτών τονίστηκε από τον Davidson, ο οποίος διαπίστωσε αύξηση 1.5-4% του MCV και πλασματική αύξηση του αιματοκρίτη σε ασθενείς με διαβητική κέτωση. Στις κετώσεις χωρίς υπερόσμωση δεν παρατηρήθηκε. Αντίθετα σε υποοσμωτικές καταστάσεις υπονατριαιμία και υπολευκωματινουρία παρατηρήθηκε το αντίθετο artifact, με μείωση του MCV και του αιματοκρίτη. Σε περίπτωση που το δείγμα είναι αιμολυμένο ελαττώνονται τα RBC και παραβλάπτονται οι δείκτες.
 
5.2 ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΛΕΥΚΩΝ
Στον πίνακα ΙΙ φαίνονται τα κυριότερα σφάλματα που επιδρούν στις λευκοκυτταρικές παραμέτρους και οφείλονται σε κάποια ανωμαλία του δείγματος.
----------------------------------------------------------------------------------------------------
λευκά ψευδώς αυξημένα                                      λευκά ψευδώς ελαττωμένα
----------------------------------------------------------------------------------------------------
εμπύρηνα ερυθρά                                                       κυτταρική λύση

ερυθρά ανθεκτικά στα λυτικά                                      παλαιό δείγμα

συγκρίματα αιμοπεταλίων                                          λευχαιμία (ΧΛΛ)

λιποσταγονίδια                                                           ουραιμία

γιγάντια αιμοπετάλια                                       φάρμακα (κυκλοφωσφαμίδη)

ηπαρίνη                                                                     συγκόλληση

ινική                                                                           αντισώματα

κρυοσφαιρίνες                                                               βλέννη

πλασμώδια                                                                μικροπήγματα
----------------------------------------------------------------------------------------------------
Η κυτταρική λύση συχνά αφορά τα λεμφοκύτταρα τα οποία μόνο σε ορισμένους αναλυτές διαφεύγουν κάτω από το όριο που θέτει το software του αναλυτή. Κατά τον τρόπο αυτό γίνεται υποεκτίμηση του αριθμού των λευκών ειδικά στην χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία.
Τα εμπύρηνα ερυθρά στους περισσότερους αιματολογικούς αναλυτές περιλαμβάνονται στην μέτρηση των λευκών. Η διόρθωση γίνεται με βάση τον συνολικό αριθμό των εμπυρήνων κυττάρων ("λευκά" του αναλυτή) και την αναλογία των εμπυρήνων ανά 100 λευκά στο επίχρισμα. Μερικοί αναλυτές επιχειρούν διόρθωση του αριθμού των λευκών όπως οι αναλυτές Cell Dyn 3000 και 3500 (Αbbott), ενώ ο αναλυτής Cell Dyn 4000 (Abbott) παρέχει άμεση μέτρηση του απολύτου αριθμού των εμπυρήνων ερυθρών.
Δείγματα ασθενών με αιμοσφαιρινοπάθειες, ηπατική ανεπάρκεια, το νεογνικό αίμα και άλλες σπανιότερες περιπτώσεις έχουν ερυθρά ανθεκτικά στα μαλακά λυτικά αντιδραστήρια ορισμένων μόνο αναλυτών. Στην περίπτωση αυτή αυξάνεται πλασματικά ο αριθμός των λευκών μόνο στον δεδομένο αναλυτή.
 
5.3 ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΩΝ
Στον πίνακα ΙΙΙ φαίνονται τα κυριότερα σφάλματα που επιδρούν στην μέτρηση των αιμοπεταλίων και οφείλονται σε κάποια ανωμαλία του δείγματος.
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
αιμοπετάλια ψευδώς αυξημένα                               αιμοπετάλια ψευδώς ελαττωμένα
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
μικροποικιλλοκύτταρα                                                     μικροπήγματα

εκσεσημασμένη μικροκυττάρωση                                συγκρίματα λόγω EDTA

αιμοσφαιρινοπάθεια Η                                                         δορυφορισμός

θραύσματα λευκών                                                    συγκολλητίνες αιμοπεταλίων

πλασμώδια                                                                             ηπαρίνη

επιμόλυνση διαλυμάτων                                              γιγαντιαία αιμοπετάλια
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Η ψευδοθρομβοπενία οφείλεται σε συνάθροιση των αιμοπεταλίων παρουσία EDTA και σπάνια στην ηπαρίνη ή το κιτρικό νάτριο. Μπορεί να παραπλανήσει τον κλινικό, οδηγώντας σε αναίτιες εξετάσεις και ίσως σε επώδυνους διαγνωστικούς χειρισμούς (μυελόγραμμα, οστεομυελική βιοψία κ.ο.κ). Οφείλεται σε παρουσία συγκολλητινών εξαρτωμένων από το EDTA έναντι της αιμοπεταλιακής γλυκοπρωτεϊνης gpIIb-IIIa. Δεν παρατηρείται συσχέτιση με κάποια αυτοάνοση ή άλλη οντότητα και παρατηρείται συχνότερα σε ασυμπτωματικά άτομα. Η μείωση του αριθμού των αιμοπεταλίων επιτείνεται με την παρέλευση του χρόνου. Αναστέλλεται όταν το δείγμα τοποθετηθεί αμέσως μετά την αιμοληψία στους 37 βαθμούς C. Όταν όμως επιτευχθεί συγκόλληση δεν είναι αναστρέψιμη στους 37 βαθμούς C όπως συμβαίνει με τις ψυχροσυγκολλητίνες των ερυθροκυττάρων. Στο κιτρικό νάτριο δεν παρατηρείται συνήθως το φαινόμενο ενώ στο μικροσκόπιο φαίνονται σωροί αιμοπεταλίων μόνο στο δείγμα με EDTA. Οι σωροί μετριούνται στον αναλυτή σαν λευκά, έτσι ώστε έχουμε πλασματική αύξηση του WBC.
Η ψευδοθρομβοκυττάρωση λόγω παρεμβολής μικροποικιλλοκυττάρων στην μέτρηση των αιμοπεταλίων επισυμβαίνει συχνά σε ενδιάμεσα μεσογειακά σύνδρομα και κυρίως στην αιμοσφαιρινοπάθεια Η. Όταν η διάγνωση δεν είναι γνωστή, μπορεί να παραπλανήσει τον κλινικό, αλλά και στις γνωστές περιπτώσεις έχει παρατηρηθεί αναίτια προφύλαξη με ασπιρίνη ή διπυριδαμόλη. Η εκτίμηση των αιμοπεταλίων στο επίχρισμα και η μέτρηση με οξαλικό αμμώνιο σε πλάκα Neubawer αποτελεί πρακτική μέθοδο του υπολογισμού του πραγματικού αριθμού των αιμοπεταλίων.

ΨΕΥΔΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΤΙΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΑΙΜΑΤΟΣ ΑΠΟ ΠΑΡΕΜΒΟΛΗ ΕΝΔΟΓΕΝΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ

Ψευδή Αποτελέσματα στις Βιοχημικές Εξετάσεις Αίματος λόγω παρεμβολής ενδογενών παραγόντων (Factitious Results in Clinical Chemistry Tests Caused by Common Endogenous Interferents)    

Sudarat Piyophirapong, M.D., Wanida Wongtiraporn, M.D., Kosit Sribhen, M.D.

Department of Clinical Pathology, Faculty of Medicine Siriraj Hospital, Mahidol University, Bangkok 10700, Thailand.

Siriraj Med J 2010;62:185-188

E-journal: http://www.sirirajmedj.com                                                                                                                                                                                                         

Η συνολική διαγνωστική εργαστηριακή διαδικασία απαρτίζεται από την προ-αναλυτική, την αναλυτική και την μετα-αναλυτική φάση. Η διαχείριση για την εξασφάλιση ποιότητας πρέπει να εφαρμόζεται σε όλες τις φάσεις για να επιτυγχάνεται η ακρίβεια και η ορθότητα των εργαστηριακών αποτελεσμάτων.

Παρά την ωφέλεια από την εφαρμογή προγραμμάτων ποιοτικού ελέγχου και την βελτίωση των συσκευών των αυτόματων αναλυτών για την ελαχιστοποίηση όλων των ατελειών της εργαστηριακής διαδικασίας, εντούτοις εργαστηριακά σφάλματα εξακολουθούν να γίνονται. 

Τα περισσότερα λάθη συμβαίνουν κατά την προ-αναλυτική φάση.

Σε μια μελέτη που δημοσιεύθηκε (Plebani et al,) αναφέρθηκε ότι η κατανομή των εργαστηριακών λαθών αφορούσε την προ-αναλυτική φάση σε ποσοστό 68,2%, την αναλυτική φάση στο 13,3%, και την μετα-αναλυτική φάση στο 18,5%.

Η προ-αναλυτική φάση περιλαμβάνει όλες τις διαδικασίες πριν από την εργαστηριακή ανάλυση του δείγματος. Οι προαναλυτικοί παράγοντες περιλαμβάνουν παραμέτρους που σχετίζονται με τον ασθενή (ηλικία, φύλο, δίαιτα, stress, φάρμακα, κ.λ.π.), την διαδικασία της συλλογής του δείγματος (specimen collection) (ταυτοποίηση ασθενούς, η τεχνική της φλεβοκέντησης, η ποσότητα του δείγματος, τα είδη των αντιπηκτικών, κ.λ.π.), την μεταφορά του δείγματος, την επεξεργασία και τον χειρισμό του, και τέλος την φύλαξη και συντήρηση του δείγματος.

Οι παράγοντες της αναλυτικής φάσης αφορούν τις μεθόδους και τις συσκευές που χρησιμοποιούνται για τις εργαστηριακές μετρήσεις των αναλυόμενων δειγμάτων που σήμερα πλέον γίνονται με την χρήση προωθημένων τεχνολογικά αυτοματοιποιημένων συστημάτων.

Τέλος, οι μεταναλυτικοί παράγοντες αφορούν την αναφορά, την κατανόηση και την ερμηνεία των εργαστηριακών αποτελεσμάτων.

Επειδή η πλειονότητα των εργαστηριακών λαθών εντοπίζεται κυρίως στην προ-αναλυτική φάση και μπορεί να οδηγήσει σε απρόσφορες ή ακατάλληλες διερευνύσεις ή θεραπείες, ο εντοπισμός και η διαχείρηση των ακατάλληλων δειγμάτων συμπεριλαμβανομένων και των περιπτώσεων λανθασμένης ταυτοποίησης, των ζητημάτων της ποσότητας και της ποιότητας των συλλεγομένων δειγμάτων, παίζουν σημαντικό ρόλο στην πρόληψη των λαθών, μειώνοντας ως εκ τούτου την αδικαιολήγητη αύξηση του οικονομικού κόστους.

Τα αιμολυμένα, λιπιδαιμικά και ικτερικά δείγματα τα οποία μπορούν να ανιχνευθούν στην προ-αναλυτική φάση θωρούνται ακατάλληλα για διενέργεια των συνηθισμένων εξετάσεων κλινικής βιοχημείας του πλάσματος, λόγω της παρεμβολής βιολογικών και αναλυτικών ουσιών και παραγόντων. Επιπλέον, η παρουσία παραπρωτεϊνών παρεμβάλλεται σε πολλές βιοχημικές μετρήσεις. Η αιμόλυση (hemolysis), η λιπιδαιμία (lipemia), η υπερχολερυθριναιμία (bilirubinemia) και η παραπροτεϊναιμία (paraproteinemia) ταξινομούνται ως οι πλέον συνηθισμένες πηγές ενδογενών παρεμβαλλόμενων ουσιών (endogenous interferents) στην διαδικασία της βιοχημικής ανάλυσης.

Αιμόλυση

Ως αιμόλυση ορίζεται η απελευθέρωση ενδοκυτταρικού περιεχομένου των ερυθροκυττάρων ή άλλων κυττάρων του αίματος εντός του πλάσματος ή του ορού.

Η αιμοσφαιρίνη ειδικότερα προκαλεί εμφανή ρόζ ή κόκκινη απόχρωση του ορού ή του πλάσματος μετά την φυγοκέντρηση του δείγματος, αν η συγκέντρωση της ελεύθερης αιμοσφαιρίνης υπερβαίνε τα 300 mg/L.

Η αιμόλυση μπορεί να συμβεί in vivo ή in vitro. In vivo αιμόλυση συμβαίνει σε διάφορες κλινικές καταστάσεις όπως, η αιμολυτική αναιμία και οι αντιδράσεις μετά από μετάγγιση αίματος. Σχετίζεται με μείωση της συγκέντρωσης της απτοσφαιρίνης (Haptoglobin) καθώς και με αύξηση των επιπέδων της εμμέσου χολερυθρίνης ή και του αριθμού των δικτυοερυθροκυττάρων (reticulocytes).

In vitro αιμόλυση, που είναι η κύρια αιτία αιμόλυσης, συμβαίνει κατά την διάρκεια της αιμοληψίας ή της επεξεργασίας του δείγματος όπως αυτό συμβαίνει κατά την επαφή του δείματος του αίματος με το αλκοόλ που χρησιμοποιείται ως αντισηπτικό την στιγμή της φλεβοκέντησης, με την χρήση μικρού διαμτρήματος βελονών, σε δύσκολες αιμοληψίες, σε παρατεταμένο χρόνο περίδεσης (prolonged tourniquet time),  ζωηρή ανάδευση των δειγμάτων αίματος με το αντιπηκτικό που περιέχεται στα φιαλίδια, ή με παρατεταμένη φυγοκέντρηση σε υψηλές ταχύτητες (high speed or prolonged centrifugation).

Αιμολυμένα δείγματα αναγνωρίζονται σε ποσοστό 3,3% των συνηθισμένων δειγμάτων και αποτελούν το 40% - 70% των ακατάλληλων δειγμάτων προς εξέταση.

Η αιμόλυση μπορεί να παρεμβληθεί επηρεάζοντας τις μετρήσεις σε πολλές εξετάσεις κλινικής βιοχημείας του πλάσματος προκαλώντας ψευδή αύξηση της τιμής των τρανσαμινασών αλανίνης αμινοτρανσφεράσης [alanine aminotransferase (ALT or SGPT)] και ασπαρτικής αμινοτρανσφεράσης [aspartate aminotransferase (AST or SGOT)], της όξινης φωσφατάσης (acid phosphatase), της κρεατινίνης (creatinine), της κρεατίνης-κινάσης [creatine kinase (CK)], της γαλακτικής δεϋδρογενάσης [lactate dehydrogenase (LDH)], της λιπάσης (lipase), του μαγνησίου (magnesium), του φωσφόρου (phosphorus), του καλίου (potassium), και της ουρίας (urea), ενώ προκαλεί ψευδή μείωση της τιμής της αλβουμίνης (albumin), της αλκαλικής φωσφατάσης [alkaline phosphatase (ALP)], της χολερυθρίνης (bilirubin), των ιόντων χλωρίου (chloride), της γ-γλουταμυλτρασνφεράσης [γ-glutamyltransferase (GGT)], της γλυκόζης (glucose) και του νατρίου (sodium).

Σε γενικές γραμμές, μια ήπια αιμόλυση δεν προκαλεί κλινικά σημαντική διαφορά στα αποτελέσματα μέτρησης των περισσότερων εργαστηριακών εξετάσεων με εξαίρεση στην μέτρηση της AST, του χλωρίου, της LDH, του καλίου και του νατρίου.

Επιπρόσθετα υπάρχουν αναφορές σε μελέτες που καταδεικνύουν υπερεκτίμηση της τιμής του φυλλικού οξέος (folate)στο πλάσμα και υποεκτίμηση της στάθμης της ινσουλίνης και της καρδιακής τροπονίνης T [cardiac troponin T (cTnT).

Μηχανισμοί παρεμβολής της αιμόλυσης (Mechanisms of hemolytic interference)

Η παρεμβολή της αιμόλυσης προκαλεί ψευδή αποτελέσματα μετρήσεων μέσω διαφόρων μηχανισμών:

·    Η απελευθέρωση ενδοκυτταρικών στοιχείων των ερυθρών αιμοσφαιρίων με υψηλή ενδοκυττάρια περικτικότητα όπως το κάλιο, οι τρανσαμινάσες (ALT, AST), η LDH, η όξινη φωσφατάση, ο σίδηρος, το φυλλικό οξύ, το μαγνήσιο, και ο φωσφόρος, εντός του πλάσματος, προκαλούν ψευδώς αυξημένα επίπεδα στις μετρήσεις αυτών των εργαστηριακών παραμέτρων. Αντίθετα, μπορούν να προκαλέσουν ψευδώς μειωμένα επίπεδα στις μετρήσεις εργαστηριακών παραμέτρων όπως είναι το νάτριο, το χλώριο ή η γλυκόζη λόγω αραίωσης (dilutional effect), επειδή η συγκέντρωση αυτών των στοιχείων είναι μικρότερη στο ενδοκυττάριο διαμέρισμα απ’ ότι είναι στο εξωκυττάριο περιβάλλον.

·    Χημική παρεμβολή (chemical interference) μπορεί να προκληθεί από μερικά ενδοκυτταρικά στοιχεία που ελευθερώνονται από τα ερυθροκύτταρα. Για παράδειγμα, η αδενυλο-κυκλάση (adenylate cyclase) θα μπορούσε να παρεμβληθεί σε μερικές μεθόδους ανάλυσης της CK. Άλλο παράδειγμα αποτελεί η υπεροξειδάση της ελεύθερης αιμοσφαιρίνης (peroxidase of free hemoglobin) η οποία παρεμβάλλεται στις αντιδράσεις απαμίνωσης (diazotization) που χρησιμοποιούνται στη μέτρηση της χολερυθρίνης, οδηγώντας σε ελαφρώς χαμηλότερες τιμές μέτρησης και οι πρωτεάσες (proteases) που ελευθερώνονται από τα ερυθροκύτταρα και οι οποίες αποδομούν την cTnT προκαλώντας ψευδώς χαμηλές τιμές.

·    Οπτική παρεμβολή (Optical interference) μπορεί να προκληθεί από τον χρωματισμό της αιμοσφαιρίνης. Η αιμοσφαιρίνη αρχίζει να απορροφά την φωτεινή δέσμη περίπου σε μήκος κύματος 340 nm και η μέγιστη απορρόφηση γίνεται μεταξύ 540 και 580 nm. Πολλές συνηθισμένες εξετάσεις κλινικών βιοχημικών παραμέτρων του πλάσματος γίνονται με την χρήση της φασματο-φωτομετρίας (spectrophotometry)για την ανίχνευση χημικών αντιδράσεων και ως εκ τούτου μπορούν να επηρεασθούν από τις φασματο-φωτομετρικές ιδιότητες της αιμοσφαιρίνης.

Λιπιδαιμία (Lipemia)

Η λιπιδαιμία εμφανίζεται ως θολερότητα (turbidity) του ορού ή του πλάσματος η οποία είναι εμφανής πριν την διαδικασία της ανάλυσης του δείγματος. Κυρίως δημιουργείται από την παρουσία μεγάλων σωματιδίων λιπορωτεϊνών όπως των χυλομικρών (chylomicrons) ή των VLDL, το κύριο συστατικό των οποίων είναι τα τριγλυκερίδια (triglyceride). Η θολερότητα στον ορό γίνεται συνήθως αντιληπτή όταν η συγκέντρωση των τριγλυκεριδίων στο αίμα υπερβεί τα 300 mg/dL.

Λιπιδαιμία συνήθως προκαλείται από την πρόσληψη τροφής με υψηλή περικτικότητα σε λίπος. Τα χυλομικρά ανιχνεύονται στο πλάσμα μετά από 6 – 12 ώρες  από την κατανάλωση λιπαράς τροφής.

Λιπιδαιμία μπορεί να συμβεί σαν αποτέλεσμα διαταραχής του μεταβολισμού των λιποπρωτεϊνών καθώς επίσης και σε παρεντερική διατροφή.

Η λιπιδαιμική παρεμβολή απαντάται συχνά στις συνηθισμένες εξετάσεις της κλινικής βιοχημείας. Όχι μόνο μπορεί να επηρρεάσει τις μετρήσεις του ουρικού οξέος, της γλυκόζης, του φωσφόρου, της ολικής χολερυθρίνης και του ολικού λευκώματος, αλλά προκαλούν επίσης ψευδώς αυξημένες τιμές στην ολική χοληστερόλη και στο κλάσμα της HDL-χοληστερόλης.

Η υπερφυγοκέντρηση (Ultracentrifugation) μπορεί να απαλείψει την θολερότητα (turbidity) των  λιπιδαιμικών δειγμάτων και το καθαρό υπερκείμενο στρώμα (infranatant) που λαμβάνεται με αυτό τον τρόπο μπορεί στη συνέχεια να αναλυθεί.

Με αυτή την τεχνική μπορούν να επιτευχθούν πιο ακριβείς μετρήσεις. Με τον ίδιο τρόπο επίσης, η λιπιδαιμία μπορεί να επηρρεάσει τις μετρήσεις στη συγκέντρωση του νατρίου στο πλάσμα προκαλώντας ψευδοϋπονατριαιμία.

Μηχανισμοί Λιπιδαιμικής Παρεμβολής (Mechanisms of lipemic interference)

Υπάρχουν αναφορές που υποδηλώνουν ότι η λιπιδαιμία παρεμβάλλεται στα αποτελέσματα των εξετάσεων μέσω των παρακάτω μηχανισμών:

Η θολερότητα παρεμβάλλεται στους φασματοφωτομετρικούς (spectrophotometric) και στους νεφελομετρικούς (turbidimetric or nephelometric) προσδιορισμούς μέσω διάχυσης (scattering) ή απορρόφησης (absorption) της δέσμης φωτός. Τα χυλομικρά (chylomicrons) τα οποία είναι και τα λιγότερο πυκνά σωματίδια δημουργούν ένα κρεμώδες στρώμα που επιπλέει ενώ οι λιποπρωτεΐνες με πολύ χαμηλή πυκνότητα (Very Low Density Lipoproteins – VLDL) προκαλούν πιο ομοιογενή θολερότητα. Ο βαθμός της διάχυσης της φωτεινής δέσμης διαφέρει, εξαρτώμενη από το μέγεθος, το σχήμα και την σύσταση των σωματιδίων των λιποπρωτεϊνών. Η θολερότητα μπορεί να επηρρεάσει την απορρόφηση στην φασματοφωτομετρία σχεδόν σε όλα τα μήκη κυμάτων της φωτεινής ακτινοβολίας και ως εκ τούτου οι τιμές των αναλύσεων μπορεί να μην είναι σωστές.

Η υπερλιπιδαιμία μπορεί να προκαλέσει ψευδοϋπονατριαιμία, αν το νάτριο του πλάσματος μετρηθεί με την χρήση έμμεσου ιοντο-επιλεκτικού ηλεκτροδίου [indirect ion-selective electrode (ISE)] ή με την μέθοδο της φλογοφωτομετρίας (flame photometry) επειδή το νάτριο του ορού περιορίζεται στο υδάτινο μέρος του ορού και η αύξηση της συγκέντρωσης των λιπιδίων στον ορό θα απωθήσει το υδάτινο διαμέρισμα (water compartment) οδηγώντας σε μείωση της κατ’ όγκον αναλογικής του σχέσης προς τον συνολικό όγκο του πλάσματος. Αυτό το αποτέλεσμα δεν παρατηρείται αν το νάτριο στον ορό μετρηθεί με την χρήση άμεσου ιοντο-επιλεκτικού ηλεκτροδίου (direct ion-selective electrode).

Υπερχολερυθριναιμία (Bilirubinemia)

Η χολερυθρίνη προέρχεται από τον καταβολισμό της αίμης. Υπερχολερυθριναιμία μπορεί να παρατηρηθεί σε ηπατικές ή αιμολυτικές παθήσεις. Ο κύριος τύπος της χολερυθρίνης σε περίπτωση αιμολυτικού ικτέρου (hemolytic jaundice) είναι η έμμεση ή μη συνδεδεμένη χολερυθρίνη (unconjugated bilirubin) ενώ ο κύριος τύπος σε ηπατοκυτταρικό ίκτερο (hepatocellular jaundice) ή σε αποφρακτικό ίκτερο (obstructive jaundice) είναι η άμεση ή συνδεδεμένη χολερυθρίνη (conjugated bilirubin).

Μετά την φυγοκέντρηση του δείγματος, η υπερχολερυθριναιμία μπορεί να γίνει εμφανής ως ικτερικός ορός (icteric serum). Όμως η οπτική εκτίμηση (visual assessment) δεν είναι ευαίσθητη ως μέθοδος και μπορεί να είναι αναξιόπιστη όταν συγκρίνεται με την φασματομετρική μέθοδο μέτρησης. Από παλαιότερες μελέτες έχει φανεί ότι η χολερυθρίνη παρεμβαίνει στον προσδιορισμό μέτρησης της κρεατινίνης, της γλυκόζης, της χοληστερόλης, των τριγλυκεριδίων, του φωσφόρου, του ορικού οξέος και της ολικής πρωτεΐνης. Επιπρόσθετα, η εκσεσημασμένη υπερχολερυθριναιμία μπορεί να προκαλέσει ψευδώς θετικά αποτελέσματα στον προσδιορισμό της ακεταμινοφαίνης.

Μηχανισμοί Παρεμβολής της Χολερυθρίνης (Mechanisms of bilirubin interference)

Η παρεμβολή στις μεθόδους ανάλυσης λόγω της παρουσίας της χολερυθρίνης γίνεται μέσω:

Φασματικής Παρεμβολής (Spectral Interference)

Η παρεμβολική δράση της χολερυθρίνης οφείλεται στις ιδιότητες της φασματικής απορρόφησης της σε μήκη κύματος μεταξύ 340 και 500 nm. Η υπερχολερυθριναιμία προκαλεί  έντονη απορρόφηση η οποία είναι ανάλογη της συγκέντρωσής της. Έτσι, κυρίως παρεμβάλλεται στις φασμοτοφωτομετρικές μετρήσεις.

Χημικής Παρεμβολής (Chemical Interference)

Η χολερυθρίνη μπορεί να αντιδρά χημικά με διάφορα αντιδραστήρια. Λόγω του ότι η χολερυθρίνη αντιδρά με την υπεροξειδάση, το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H₂O₂) που παράγεται κατά την χημική αντίδραση προκαλεί ψευδώς χαμηλές μετρήσεις στον προσδιορισμό της κρεατινίνης, της γλυκόζης, της χοληστερόλης των τριγλυκεριδίων και του ουρικού οξέος.

Παραπρωτεϊναιμία και υπερανοσοσφαιριναιμία (Paraproteinemia and Hyperimmunoglobulinemia)

Οι παραπρωτεΐνες βρίσκονται σε ασθενείς με πολλαπλό μυέλωμα (multiple myeloma) ή λεμφοϋπερπλαστικές διαταραχές (lymphoproliferative disorders).

Επιπρόσθετα, το φαιόμενο της παρεμβολής τους μπορεί να παρατηρηθεί και σε άλλες κλινικές καταστάσεις, που περιγραφόντουσαν στο πρόσφατο παρελθόν ως σπάνιες περιπτώσεις (case reports), όπως σε σκλήρυνση κατά πλάκας (multiple sclerosis) ή σε σύνδρομο Guillain-Barre, λόγω της θεραπευτικής χορήγησης ενδοφλεβίως ανοσοσφαιρινών (intravenous infusion of immunoglobulin therapy).

Οι παραπρωτεΐνες διαφέρουν από τις άλλες συνηθισμένες ενδογενείς ουσίες που προκαλούν παρεμβολή, επειδή δεν μπορούν να ανιχνευθούν γιατί δεν προκαλούν μεταβολή του χρώματος του ορού ή του πλάσματος.

Οι παρεμβολές των παραπρωτεϊνών μπορούν να συμβούν σε πολλές βιοχημικές εξετάσεις, αλλά η συχνότητα της εμφάνισής τους συνήθως υποαναφέρεται (underreported) λόγω της άγνοιας της υποκείμενης νόσου (unawareness of the underlying disease).

Η ύπαρξη τους μπορεί να εντοπισθεί από τον κλινικό ιατρό ο οποίος αναγνωρίζει ότι τέτοια παθολογικά αποτελέσματα δεν ταιριάζουν με τα συμπτώματα του ασθενούς από τον οποίο έχουν ληφθεί τα προς εξέτασιν δείγματα.

Όμως, η συχνότητα των ψευδών εργαστηριακών αποτελεσμάτων που προκαλείται από την παρεμβολή της παραπρωτεΐνης κυμαίνεται και είναι κυρίως εξατομικευμένη. Η παρεμβολή της παραπρωτεΐνης εξαρτάται επίσης και από τις συσκευές και τις μεθόδους αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται.

Έχουν αναφερθεί σπάνιες περιπτώσεις ψευδοϋπονατριαιμίας (pseudohyponatremia), ψευδοϋπογλυκαιμίας (pseudohypoglycemia), τεχνητή υπερχολερυθριναιμία (artifactial hyperbilirubinemia), τεχνητά χαμηλή HDL – χοληστερόλη (artifactially low HDL-cholesterol), ψευδοϋπερφωσφαταιμία ή υποφωσφαταιμία (pseudohyperphosphatemia or hypophosphatemia), ψευδή υπουριχαιμία (factitious hypouricemia), ψευδή υπαλβουμιναιμία (factitious hypoalbuminemia), πλαστή υποεκτίμηση στις μετρήσεις της συγκέντρωσης της ουρίας, κρεατινίνης, ή της θυροξίνης, ψευδώς αυξημένη C αντιδρώσα πρωτεΐνη ορού (spuriously increased serum C-reactive protein [CRP] και αντιστρεπτολυσίνης Ο (ASTO).

Οι παραπρωτεΐνες IgM, ως παρεμβλητικοί παράγοντες, βρίσκονται συχνά σε αυτές τις περιπτώσεις λόγω του αυξημένου μοριακού τους βάρους.

Πολλές φορές δυστυχώς γίνονται λανθασμένες διαγνώσεις γιατί οι γιατροί στηρίζονται σε αυτά τα ψευδή αποτελέσματα με αποτέλεσμα οι ασθενείς να υποβάλλονται άσκοπα σε ταλαιπωρία σε περαιτέρω έλεγχο ή και σε θεραπευτικές παρεμβάσεις. Για τον λόγο αυτό οι κλινικοί γιατροί πρέπει να ερμηνεύουν με μεγάλη προσοχή τα αποτελέσματα του εργαστηριακού ελέγχου για να αποφεύγονται αυτές οι καταστάσεις.

Μηχανισμοί παρεμβολής των παραπρωτεϊνών

Η παραπρωτεϊναιμία ή υπερανοσοσφαιριναιμία μπορεί να παρεμβληθεί και να επηρρεάσει πολλές μεθόδους μετρήσεων κλινικών βιοχημικών παραμέτρων συμπεριλαμβανομένων της νεφελομετρίας (nephelometry -turbidimentry) ή και των ανοσομετρήσεων (immunoassays).

Οι δράσεις παρεμβολής των παραπρωτεϊνών ή ανοσοσφαιρινών μπορούν να ταξινομηθούν σύφμωνα με τους παρακάτω μηχανισμούς:

     Αύξηση του ιξώδους (viscosity) του ορού ή του πλάσματος λόγω της παρουσίας των παραπρωτεϊνών που έχει σαν αποτέλεσμα μείωση του υδάτινου διαμερίσματος (water compartment). Σαν συνέπεια, οι ποσότητες των διαλυμένων στο νερό ουσιών υποεκτιμώνται ψευδώς (spuriously underestimated). Με αυτό τον μηχανισμό μπορεί να εξηγηθεί η αιτία της ψευδοϋπονατριαιμίας (pseudohyponatremia) κατά την μέτρηση του νατρίου με μεθόδους έμμεσου ιοντο-επιλεκτικού ηλεκτροδίου [indirect ion-selective electrode (ISE)].

     Καθίζηση των συμπλεγμάτων των παραπρωτεϊνών με τα αντιδραστήρια δημιουργούν θολερότητα με αποτέλεσμα παρεμβολή στις μετρήσεις που διενεργούνται με την μέθοδο της νεφελομετρίας (nephelometric assays) ή της χρωματομετρίας (colorimetric assays).

     Ανοσομετρική παρεμβολή λόγω της αλληλεπίδρασης των παραπρωτεϊνών με τα ειδικά αντιδραστήρια αντισωμάτων, που έχει ως αποτέλεσμα ψευδώς αυξημένες εργαστηριακές μετρήσεις.

Συστάσεις

Για να βελτιωθεί η ποιότητα των αποτελεσμάτων των εργαστηριακών εξετάσεων, η συνηθισμένη ενδογενής παρεμβολή λόγω αιμόλυσης, λιπιδαιμίας, ή υπερχολερυθριναιμίας θα πρέπει να εξετάζεται με γυμνό οφθαλμό μετά από την φυγοκέντρηση των δειγμάτων από το προσωπικό των εργαστηρίων και η οπτική εκτίμηση των δειγμάτων θα πρέπει να καταγράφεται στο έντυπο αναφοράς των αποτελεσμάτων. Όμως η εκτίμηση δια γυμνού οφθαλμού, έχει αναφερθεί ως αναξιόπιστη (unreliable).Αυτό μπορεί να οφείλεται στην υποκειμενική (subjective) ερημηνεία (interpretation), στο αυξημένο φορτίο εργασίας στο εργαστήριο, ή σε λάθη ταυτοποίησης των δειγμάτων από λανθασμένη τοποθέτηση ετικετών στα σωληνάρια των δειγμάτων.

Υπάρχουν ειδικοί (sophisticated) αυτόματοι αναλυτές οι οποίοι είναι σε θέση να προσδιορίσουν τον βαθμό της αιμόλυσης, της λιπιδαιμίας ή της υπερχολερυθριναιμίας που αναφέρονται ως «αιμολυτικός δείκτης» (“hemolytic index”), «λιπιδαιμικός δείκτης» (“lipemic index”) και «ικτερικός δείκτης» (“icteric index”) αντίστοιχα.

Οι τιμές των δεικτών (Index results) αντικατοπτρίζουν ημιποσοτικές μετρήσεις (semiquantitative measurements) και συσχετίζονται σε ικανοποιητικό βαθμό με τις συγκεντρώσεις των παρεμβαλλόμενων παραγόντων (interferents).

Πολλοί αυτοματοποιημένοι αναλυτές αποδείχθηκαν ότι είναι αποτελεσματικοί στο να εντοπίζουν και να κατατάσσουν τις παρεμβαλλόμενες ουσίες, ειδικότερα μάλιστα τα αιμολυμένα δείγματα που είναι ακατάλληλα για εξέταση.

Πρακτικά, το προσωπικό των εργαστηρίων μπορεί να εντοπίσει και να λύσει τα προβλήματα που δημιουργούνται από παρεμβολή είτε γιατί οι αναλυτές καταδεικνύουν την ύπαρξη προβλημάτων μέσω συστήματων υπόδειξης (flagging systems) καθώς επίσης και με αξιολόγηση της εργαστηριακής διαδικασίας πριν εκδώσουν και ανακοινώσουν τα αποτελέσματα προς τους κλινικούς γιατρούς.

Επειδή η παρεμβολή κυρίως προκαλείται από την in vitro αιμόλυση, η οποία συμβαίνει κατά την διάρκεια της διαδικασίας λήψης του δείγματος αίματος, η τυποποίηση (standardization) της τεχνικής της φλεβοτομίας (phlebotomy technique) και η εκπαίδευση παίζουν σημαντικό ρόλο στην επιτυχημένη διεκπεραίωση της προαναλυτικής εργαστηριακής διαδικασίας,

Είναι σημαντικό να χρησιμοποιούνται βελόνες κατάλληλου διαμετρήματος (appropriate bore size) για την συλλογή δειγμάτων αίματος ενώ ο χρόνος ίσχαιμης περίδεσης (tourniquet time) πρέπει να διαρκεί λιγότερο του 1 min προκειμένου να μειωθεί ο κίνδυνος της αιμόλυσης.

Επειδή οι επιδράσεις από την αιμόλυση, την λιπιδαιμία, την χολερυθρίνη και τις παραπρωτεΐνες πάνω σε μερικές εργαστηριακές παραμέτρους εξαρτώνται από την μέθοδο που χρησιμοποιείται για την μέτρηση ή και από τις συσκευές ανάλυσης, είναι δύσκολο να προβλέψει κανείς σε ποιά δείγματα θα δημιουργηθεί παρεμβολή.

Οι κλινικοί γιατροί πρέπει να είναι προσεκτικοί στην ερμηνεία των εργαστηριακών εξετάσεων που έχουν στα χέρια τους λόγω της πιθανότητας ύπαρξης ψευδών αποτελεσμάτων στις κλινικές βιοχημικές εξετάσεις από την παρεμβολή ενδογενών παραγόντων ανάλογα με την ξεχωριστή περίπτωση κάθε ασθενούς.

REFERENCES

1. Plebani M, Carraro P. Mistakes in a stat laboratory: types and frequency.

Clin Chem. 1997 Aug;43(8 Pt 1):1348-51.

2. Guder WG, Berlin F, Heil W, Schmitt YM, Weisser H, Zawta B. The

haemolytic, icteric and lipemic sample. Recommendations regarding their

recognition and prevention of clinically relevant interferences. J Lab Med.

2000;24(8):357-64.

3. Lippi G, Blanckaert N, Bonini P, Green S, Kitchen S, Palicka V, et al.

Haemolysis: an overview of the leading cause of unsuitable specimens

in clinical laboratories. Clin Chem Lab Med. 2008; 46(6):764-72.

4. Yucel D, Dalva K. Effect of in vitro hemolysis on 25 common biochemical

tests. Clin Chem. 1992 Apr;38(4):575-7.

5. Lippi G, Salvagno GL, Montagnana M, Brocco G, Guidi GC. Influence

of hemolysis on routine clinical chemistry testing. Clin Chem Lab Med.

2006;44(3):311-6.

6. Dalal BI, Brigden ML. Factitious biochemical measurements resulting

from hematologic conditions. Am J Clin Pathol. 2009 Feb;131(2):195-204.

7. Cook PR, Glenn C, Armston A. Effect of hemolysis on insulin determination

by the Beckman Coulter Unicell DXI 800 immunoassay analyzer.

Clin Biochem. 2010 Apr;43(6):621-2.

8. Lyon ME, Ball CL, Krause RD, Slotsve GA, Lyon AW. Effect of hemolysis

on cardiac troponin T determination by the Elecsys 2010 immunoanalyzer.

Clin Biochem. 2004 Aug;37(8):698-701.

9. Kroll MH, Elin RJ. Interference with clinical laboratory analyses. Clin

Chem. 1994 Nov;40(11 Pt 1):1996-2005.

10. Sodi R, Darn SM, Davison AS, Stott A, Shenkin A. Mechanism of interference

by haemolysis in the cardiac troponin T immunoassay. Ann Clin

Biochem. 2006 Jan;43(Pt 1):49-56.

11. Jabbar J, Siddiqui I, Raza SQ, Baig A. To compare the total cholesterol

and HDL-cholesterol before and after ultra-centrifugation in lipemic samples.

J Pak Med Assoc. 2005 Jun;55(6):239-42.

12. Weisberg LS. Pseudohyponatremia: a reappraisal. Am J Med. 1989 Mar;

86(3):315-8.

13. Glick MR, Ryder KW, Glick SJ, Woods JR. Unreliable visual estimation

of the incidence and amount of turbidity, hemolysis, and icterus in serum

from hospitalized patients. Clin Chem. 1989 May;35(5):837-9.

14. Grafmeyer D, Bondon M, Manchon M, Levillain P. The influence of

bilirubin, haemolysis and turbidity on 20 analytical tests performed on

automatic analysers. Results of an interlaboratory study. Eur J Clin Chem

Clin Biochem. 1995 Jan;33(1):31-52.

15. Bertholf RL, Johannsen LM, Bazooband A, Mansouri V. False-positive

acetaminophen results in a hyperbilirubinemic patient. Clin Chem. 2003

Apr;49(4):695-8.

16. Duncanson GO, Worth HGJ. Pseudohypophosphataemia as a result of

bilirubin interference. Ann Clin Biochem. 1990 May;27( Pt 3):263-7.

17. Bern M. Clinically significant pseudohyponatremia. Am J Hematol. 2006

Jul;81(7):558-9.

18. Steinberger BA, Ford SM, Coleman TA. Intravenous immunoglobulin

therapy results in post-infusional hyperproteinemia, increased serum viscosity,

and pseudohyponatremia. Am J Hematol. 2003 Jun;73(2):97-100.

19. Colls BM. Guillain-Barreé syndrome and hyponatraemia. Intern Med J.

2003 Jan-Feb;33(1-2):5-9.

20. Wenk RE, Yoho S, Bengzan A. Pseudohypoglycemia with monoclonal

immunoglobulin M (letter). Arch Pathol Lab Med. 2005 Apr;129(4):454-5.

21. Pantanowitz L, Horowitz GL, Upalakalin JN, Beckwith BA. Artifactual

hyperbilirubinemia due to paraprotein interference. Arch Pathol Lab Med.

2003 Jan;127(1):55-9.

22. Kadri N, Douville P, Lachance P. Monoclonal paraprotein may interfere

with the Roche direct HDL-C plus assay. Clin Chem. 2002 Jun;48(6 Pt 1):

964.

23. Smogorzewska A, Flood JG, Long WH, Dighe AS. Paraprotein inter

ference in automated chemistry analyzers. Clin Chem. 2004 Sep;50(9):

1691-3.

24. McClure D, Lai LC, Cornell C. Pseudohyperphosphataemia in patients

with multiple myeloma. J Clin Pathol. 1992 Aug;45(8):731-2.

25. Bowles SA, Tait RC, Jefferson SG, Gilleece MH, Haeney MR. Characteristics

of monoclonal immunoglobulins that interfere with serum inorganic

phosphate measurement. Ann Clin Biochem. 1994 May;31(Pt 3):

249-54.

26. Yu A, Pira U. False increase in serum C-reactive protein caused by monoclonal

IgM-lambda: a case report. Clin Chem Lab Med. 2001 Oct;

39(10):983-7.

27. Yamada K, Yagihashi A, Ishii S, Tanemura K, Kida T, Watanabe N, et al.

Interference with nephelometric assay of C-reactive protein and antistreptolysin-

O by monoclonal IgM from a myeloma patient. Clin Chem. 1997

Dec;43(12):2435-7.

28. Lippi G, Luca SG, Blanckaert N, Giavarina D, Green S, Kitchen S, et al.

Multicenter evaluation of the hemolysis index in automated clinical chemistry

systems. Clin Chem Lab Med. 2009;47(8):934-9.

29. Lippi G, Salvagno GL, Montagnana M, Brocco G, Cesare Guidi G. Influence

of the needle bore size used for collecting venous blood samples

on routine clinical chemistry testing. Clin Chem Lab Med. 2006;44(8):

1009-14.

30. Saleem S, Mani V, Chadwick MA, Creanor S, Ayling RM. A prospective

study of causes of haemolysis during venepuncture: tourniquet time

should be kept to a minimum. Ann Clin Biochem. 2009 May;46(Pt 3):

244-6.